C. Un après-midi en présence de spécialistes

Le jeudi 17 janvier 2013 nous sommes allées à l’institut d’immunopathologie de l’hôpital Molinette de Turin pour suivre le travail de deux spécialistes qui nous ont proposé de nous aider dans notre TPE : M. Cantaluppi et M. Medica.

Photographie représentant l’hôpital

Nous avons assisté à une expérience qui consiste à congeler des cellules humaines provenant des tubules rénaux.

Ces cellules se trouvaient en culture, à l’intérieur de récipients en plastique comportant un liquide nutritif, appelé RPMI 1640, constitué d’électrolytes, de nutriments comme le glucose et d’acides aminés pour garantir leur croissance. Ce liquide doit être substitué périodiquement puisque ; quand les cellules sont en culture, leur métabolisme est actif et donc il sécrète des substances qui acidifient le liquide de culture en faisant diminuer son pH. Les cellules sont accrochées à une des parois du récipient en plastique qui les contient et elles sont conservées dans un incubateur à une température de 37°C.

Toutes les étapes des expériences ont été effectuées sous une hotte à flux laminaires pour éviter d'éventuelles contaminations bactériennes.

Hotte à flux laminaires

Nous allons donc expliquer le processus mis en œuvre pour congeler ces cellules.

Tout d’abord l’un des deux médecins : M. Medica, a prélevé de l’incubateur l’un des récipients contenant les cellules.

Ensuite, il a aspiré le liquide nutritif dont nous avons parlé auparavant, et il a lavé les cellules avec une solution constituée de chlorure de sodium, qui a la même osmolarité que les cellules, et de trypsine. Cette solution permet aux cellules de se détacher de la parois en plastique à laquelle elles sont collées. Le récipient où se trouvent les cellules va donc être à nouveau positionné à l’intérieur de l’incubateur à une température de 37°C pour une période de 5 minutes, ainsi les cellules sont séparées de la parois et restent flottantes dans la solution citée précédemment.

A l’aide d’une pipette, M. Medica prélève alors les cellules et la solution dans laquelle elles sont. Il a ensuite inséré les cellules et le liquide où elles se trouvaient dans un numéro paire d’éprouvettes. Un numéro paire sert pour équilibrer la centrifuge dans laquelle elles seront introduites dans un deuxième temps.

Ces éprouvettes sont donc ensuite centrifugées à 1500 tours durant une période de 5 minutes. Cette opération permet de désagréger la solution des cellules puisque ces dernières, ayant un poids majeur, vont se déposer sur le fond de l’éprouvette. Les éprouvettes sont donc retirées de la centrifuge, le liquide de la solution qu’elles avaient à l'intérieur est aspiré grâce à une pipette.

Les cellules, quant à elles, elles sont réparties équitablement dans quatre nouvelles éprouvettes qui ont été refroidies auparavant. Parmi ces quatre éprouvettes deux vont être congelées après y avoir ajouté un cryoprotecteur : le DMSO, c’est-à-dire le diméthyl sulfoxide, à la concentration suivante : 90% de liquide nutritif et 10% de DMSO. Ces opérations doivent être réalisées rapidement puisque, à température ambiante, le cryoprotecteur peut endommager les cellules.

Nous voyons dans cette photo M. Medica introduisant le DMSO dans une éprouvette

Les deux autres éprouvettes vont être congelées de la même manière mais sans l’adjonction du cryoprotecteur.

Ces quatre éprouvettes vont être placées dans un congélateur pendant 24 heures. Ensuite, elles vont être déplacées dans de l’azote liquide où elle peuvent rester durant une période indéterminée.

Nous pouvons ici observer les deux médecins occupés à retirer les cellules du congélateur après 24 qu’elles s'y trouvaient

A présent, nous allons expliquer le processus appliqué pour décongeler les cellules et les récupérer sans qu'elles ne soient mortes.

Les éprouvettes où se trouvent les cellules, après avoir été prélevées de l’azote liquide, vont être immergées dans l’eau chaude pour qu’elles arrivent rapidement à une température de 37°C. Ainsi, les quatre éprouvettes sont décongelées.

Nous pouvons apercevoir M. Medica secouant une éprouvette dans l’eau chaude pour qu’elle atteigne une température de 37°C

Ensuite, elles vont être nouvellement centrifugées à 1500 tour pendant 5 minutes de telle sorte que les cellules puissent se déposer au fond des éprouvettes et être ainsi prélevées.

Les cellules sont donc à nouveau mises en culture dans les récipients en plastique avec du liquide nutritif et sont positionnées dans l’incubateur à 37°C. Après une période de 3-4 minutes, les récipients sont retirés de l’incubateur.

Sachant que les cellules vivantes s’attachent à une des parois du récipient qui les contient, et qu'au contraire les cellules mortes flottent dans le liquide nutritif, nous avont observé les différents récipient. Ceux qui contenaient des cellules congelées avec du DMSO présentaient un grand nombre de cellules collées à une des parois, tandis que, ceux qui contenaient des cellules congelées sans cryoprotecteur présentaient des cellules flottantes dans le liquide nutritif : c’est-à-dire des cellules mortes.

Nous avons enfin observé les cellules au microscope. M. Medica les avait colorées avec une solution de Trypan bleu qui permet d’évaluer la quantité de cellules vivantes. Effectivement si les cellules prenaient une coloration bleutée, cela signifiait qu’elles étaient vivantes, tandis que si elles ne prenaient pas de couleur cela voulait dire qu’elles étaient mortes.

Nous pouvons voir M. Medica qui est en train de transposer les solutions avec du Trypan bleu sur une lamelle, à l’aide d’une pipette, afin de les observer

Microscope avec lequel nous avons pu observer les cellules dans les récipients qui les contenaient

A l’aide des deux photographies qui suivent nous pouvons effectivement noter la différence entre les cellules congelées sans le cryoprotecteur (a) et celles congelées avec le DMSO (b) :

(a) (b)

 Nous pouvons ainsi remarquer qu’un nombre élevé de cellules congelées ont survécu grâce à la présence du DMSO, tandis que les cellules congelées sans cryoprotecteur sont complètement mortes.

En conclusion, nous pouvons affirmer que cette expérience nous a permis de démontrer que :

-  Les cellules rénales humaines peuvent être congelées

-  Les processus de congélation et de décongélation sont importants et doivent être faits correctement

-  La conservation et la reprise de l’activité cellulaire après la congélation peuvent se faire seulement à l’aide d’un cryoprotecteur, même si leur survie n’est pas égale au 100%

Nous devons donc remercier M. Medica qui, grâce au travail qu’il a réalisé sous la supervision de M. Cantaluppi, nous a aidées à démontrer que nous pouvons congeler des cellules à l’aide de cryoprotecteurs.